Hematopoeza, hemostaza, fibrinoliza

Eritropoeza

> Etapele eritropoezei: formarea hematiilor are ca punct de plecare celula stem hematopoetica din care provine proeritoblastul, celula cap-de-serie, nucleata, cu nucleu veziculos, halou clar perinuclear, de dimensiuni mari (18-25 µm), cu citoplasma bogata în ARN deci intens bazofila. Urmatoarele etape se caracterizeaza prin diminuarea treptata a dimensiunilor celulei, condensarea cromatinei nucleare pâna la degenerescenta nucleului si încarcarea progresiva a citoplasmei cu Hb. Din proeritroblast ia nastere eritroblastul bazofil (16-18 µm), apoi eritroblastul policromatofil (15 µm)¸ marcând astfel acumularea Hb în citoplasma si caracterul acidofil al acesteia, urmeaza eritroblastul acidofil/oxifil (10-12 µm) care poseda un nucleu picnotic care se deplaseaza treptat catre periferia celului (devine excentric), urmând a fi expluzat si fagocitat de macrofagele medulare. Dupa expluzia nucleului, celula devine reticulocit (7 µm) care mai prezinta resturi de poliribozomi. Reticulocitul paraseste maduva si trece în circulatia generala (eritrodiabaza), se maturizeaza în 48 ore si devine hematie adulta. În cursul celor 4 diviziuni din timpul eritropoezei, fiecare eritroblast poate da nastere la 16 hematii, iar durata totala a procesului pâna la reticulocit este de 5-7 zile.

> Sediile eritropoezei:

o la embrion si fat

· Etapa mezoblastica: are loc extraembrionar, intravascular în celulele sacului vitelin. Dureaza pâna în S5.

· Etapa hepato-splenica: ficat, splina, timus, ganglioni limfatici. Dureaza pâna în LVI.

· Etapa medulara: începe în LV si are ca sediu principal maduva osoasa.

o la adult

· Imediat dupa nastere toata maduva osoasa e hematogena. La adult maduva "rosie" se restrânge la nivelul corpurilor vertebrale, stern, coaste, scapula, epifizele oaselor lungi. În oasele lungi, maduva hematogena este înlocuita cu tesut adipos (maduva galena). Maduva hematogena e în raport cu un debit circulator crescut (cca. ¼ din debitul cardiac), reflectând schimburile metabolice active.

> Reglarea eritropoezei:

Se face prin mecanisme de tip feedback asupra celulelor nediferentiate în functie de necesarul tisular de O2. Semnalul declansator îl constituie produsii de degradare ai Hb, aparuti în urma unei hemolize intense, efectul fiind stimularea eritropoezei. Reglarea se face de 2 cai:

o umoral :

· se face prin eritropoetina si IL3.

· IL3 este o glicoproteina cu GM de 32 Kda, ce actioneaza asupra celulelor pluripotente timpurii, pentru autoîntretinere (hematopoieza homoplastica) si pt. diferentierea celulelor pluripotente, în celule diferentiate "comise" (hematopoieza heteroplastica => 2 celule fiice ce difera de celula mama)

· Eritropoetina e sintetizata 90% în corticala renala si 10% în ficat, stimulul sau fiind hipoxia tisulara si în special hipoxia celulelor epiteliale glomerulare renale. Eritropoetina initiaza sinteza de Hb la nivel medular, scurteaza timpul de tranzit medular al eritroblastilor în curs de maturare si stimuleaza eliberarea de reticulocite în sângele periferic (eritrodiabaza).

· Eritropoeza mai necesita vitamina B12 (in deficit de factor intrinsec Castle - necesar absorbtiei vitaminei B12 - apare anemia pernicioasa/megaloblastica Biermer), acid folic, Fe, Co, Cu, vit. B6, acid pantotenic, acid ascorbic, vitamina B2, vitamina PP. Vitamina B12 si acidul folic intervin în sinteza acizilor nucleici. Cuprul circula în plasma încorporat în ceruloplasmina (proteina cu rol de feroxidaza, favorizând legarea Fe de transferina) iar în eritrocit se gaseste sub forma de eritrocupreina, cu rol în procese de oxido-reducere.

o nervos - scaderea presiunii partiale a O2 stimuleaza chemoreceptorii sinocarotidieni si pe cale reflexa prin intermediul nervilor splahnici se transmit semnale la nivelul MH si este crescuta eliberarea de reticulocite si hematii tinere pentru corectarea aportului de O2.

o hormonal - dintre hormonii care stimuleaza eritropoieza, amintim:

· STH

· Tiroxina

· Testosteronul

· Catecolaminele

Exista si hormoni care inhiba eritropoeza: estrogenii.

Leucopoeza

Leucopoeza are loc în maduva osoasa hematogena si în organele limfoide (timus, splina) sub influenta unor factori stimulatori = limfokine (apartin familiei citokinelor).

Formarea leucocitelor porneste de la celula stem (susa) omnipotenta si urmeaza etape diferite pentru seria granulocitara, limfocitara si monocitara.

· Seria granulocitara:

o pornind de la celula stem ia nastere mieloblastul (20 µm), cu nucleu mare si multi nucleoli, citoplasma bazofila, fara granule (raport nucleocitoplasmatic=4:1).

o din mieloblast se formeaza promielocitul (10-20 µm), nucleul începe sa scada în dimensiuni în favoarea citoplasmei, care prezinta primele granulatii (granule primare, nespecifice, azurofile)

o în continuare se formeaza mielocitul (neutrofil, eozinofil sau bazofil) => metamielocitul (neutrofil, eozinofil sau bazofil) => granulocitul nesegmentat => granulocitul segmentat

> mielocitul neutrofil (18 µm) - raportul nucleocitoplasmatic devine 2:1 pâna la 1:1, citoplasma prezinta granulatii bazofile si acidofile => metamielocitul neutrofil (12-18 µm) - raportul nucleocitoplasmatic devine 1:1, nucleul ia forma de potcoava, citoplasma capata granulatii specifice, secundare => neutrofile nesegmentate (16 µm) => neutrofile segmentate (=> neutrofil hipersegmentat)

> mielocit eozinofil (18 µm) - raport nucleocitoplasmatic 2:1 sau 1:1, citoplasma prezinta granule eozinofile => metamielocitul eozinofil (18 µm) - citoplasma prezinta numeroase granule acidofile => eozinofil nesegmentat (16 µm) => eozinofil segmentat

> mielocitul bazofil (18 µm) - apar granule specifice în citoplasma => metamielocitul bazofil (18 µm) - nucleul capata forma de potcoava, granulele citoplasmatice sunt în numar mare => bazofilul nesegmentat => bazofilul segmentat

· Seria monocitara:

o pornind de la celule stem se formeaza monoblastul (12-20 µm) - cu nucleu mare, rotund-ovalar, iar citoplasma putina, bazofila, fara granulatii.

o din monoblast ia nastere monocitul tânar (12-20 µm) - nucleul începe sa scada în dimensiuni, iar citoplasma se încarca cu granule fine, azurofile.

o În final se formeaza monocitul adult.

· Seria limfocitara - diferentierea se face în MH si în timus

o din celula stem apare limfoblastul (20 µm) - raport nucleocitoplasmatic este 4:1, citoplasma este putina, bazofila, fara granulatii.

o în continuare se formeaza limfocitul tânar (9-18 µm) si din acesta limfocitul adult

Trombocitopoeza

· Formarea seriei trombocitare porneste tot de la celula stem => megacarioblastul (50 µm), celula de talie mare cu citoplasma putina, bazofila si nucleu mare, cu multi nucleoli => promegacariocit (80 µm), citoplasma prezinta granulatii azurofile => megacariocit trombocitogen (160 µm) - nucleu polilobulat, fara nucleoli, citoplasma este mai abundenta si prezinta granule azurofile. În medie un magacariocit trombocitogen genereaza 7.000 de plachete. Clearance-ul trombocitelor se face prin procesul de hemostaza sau prin fagocitare de catre macrofagele tisulare, în splina si ficat.

· Reglarea trombocitopoezei:

o Factori stimulatori: IL1, IL3, trombopoetina, eritropoetina.

o Factori inhibitori: TGF ß, FP4 - din granulele trombocitare, IFN, IL 4.

Mielograma (medulograma) reprezinta exprimarea procentuala a precursorilor celor 3 linii celulare prin frotiu de MH.

HEMOSTAZA = reprezinta ansamblul proceselor care se desfasoara în vedere opririi unei sângerari. Presupune mai multe etape:

Timpul vasculoplachetar:

A) Timpul vascular: postlezional, la nivel vascular are loc vasoconstrictie reflexa prin mecanism

· nervos: SNV simpatic

· umoral: serotonina, catecolamine, TXA2, histamina, Ach (pe endoteliul lezat produce VC)

B) Timpul plachetar - presupune desfasurarea a 4 etape:

1. Aderare-adeziune

o Adeziunea se face prin intermediul FvW (componenta a F VIII plasmatic) care realizeaza punti între colagenul denudat si trombocite (prin GP Ib/IX). Dupa legarea de colagen, FvW sufera modificari conformationale si capata afinitate pentru receptorii trombocitari.

2. Activare

o Activarea este declansata de ADP-ul eliberat din celulele endoteliale lezate si de TXA2 din trombocit. Consecinta a activarii trombocitare, fosfolipaza A2 (PLA2) si fosfolipaza C (PLC) sunt activate. PLA2 desprinde din fosfolipidele membranare acidul arahidonic, din care pe calea lipooxigenazei se vor forma leucotriene (LT) iar pe calea ciclooxigenazei se vor forma prostaglandine (PG), prostaciclina (PC= PGI2) si tromboxani. PLC activata mobilizeaza calciul din depozitele trombocitare si catalizeaza reactia PIP2 => IP3 + DAG; IP3 determina eliberarea de Ca din granulele dense iar DAG activeaza pKC (proteinkinaza C), care la rândul ei activeaza receptorii trombocitari IIb/IIIa.

*** TXA2 are rol vasoconstrictor si proagregant, prin scaderea AMPc intracelular, iar PC este un puternic agent antiagregant

3. Agregarea = asocierea intercelulara

o Cresterea concentratiei de Ca intracelular determina activarea unei proteine contractile = trombostenina, cu rol în eliberarea de mediatori ce intervin în hemostaza primara si secundara si în emiterea de pseudopode.

Receptorii IIb/IIIa au rol în formarea de punti de fibrinogen între trombocite.

4. Metamorfoza vâscoasa plachetara

o Trombina (rezultata prin activarea caii extrinseci a coagularii de catre tromboplastina tisulara - eliberata prin lezarea endoteliului) determina :

o conversia fibrinogenului în fibrina => puntile intercelulare se solidifica

o creste permeabilitatea membranara pentru Na => Na intra în celule si atrage osmotic apa => celulele se hiperhidrateaza, astfel încât spatiile ramase libere între pseudopode si puntile de fibrina dispar.

În urma acestei etape rezulta dopul plachetar, care este hemostatic doar pe durata mentinerii vasoconstrictiei locale.

Timpul plasmatic:

Cuprinde 3 etape:

o Formarea protrombinei cu ajutorul complexului activator al protrombinei

o Formarea trombinei

o Formarea fibrinei insolubile

Factorii plasmatici ai coagularii - se gasesc sub forma inactiva, iar activarea lor se face în cascada; factorii II, VII, IX, X necesita pentru sinteza vitamina K, fiind denumiti vitamina K-dependenti.

o F I = Fibrinogenul

> sintetizat în ficat

> concentratie plasmatica de 250-500 mg /dl;

> este o GP cu GM 340 KDa, are structura de dimer, cele 2 unitati fiind legate prin punti S-S

> fiecare monomer este alcatuit la rândul sau din 3 lanturi polipeptidice Aa,Bß,?, legate tot prin punti S-S

> este activata de trombina, eliberându-se fibrinopeptidele A si B si rezultând monomerii de fibrina

o F II = Protrombina

> sintetizata în ficat, în prezenta vitaminei K

> este o a2 glicoproteina cu GM 72KDa

> este scindata la trombina (IIa), GM 35 kDa sub actiunea protrombinazei (F Xa, F V, Ca si FP3)

o F III = tromboplastina tisulara

> intra în alcatuirea protombinazei - componenta proteica

> este sintetizata în endoteliul vascular, fractia microzomala a creierului, plamânilor, placentei

> tromboplastina are 2 componente: proteica (reprezentata de F III) si fosfoliopidica (reprezentata de fosfolipidele tisulare)

o F IV = Ca2+

> intervine aproape în toate fazele hemostazei

o F V = proaccelerina

> este o ß globulina sintetizata în ficat

> are o GM de 290 Kda, este activata de trombina si inactivata de proteina C

> deficitul = parahemofilie (Owren)

o F VI = accelerina

o F VII = proconvertina

> este o glicoproteina sintetizata în ficat, în prezenta vitaminei K

> participa la activarea F X pe calea extrinseca

> deficitul = pseudohemofilie (Alexander)

o F VIII = globulina antihemofilica A

> este sintetizata în endoteliul vascular, ficat, splina, rinichi

> este alcatuit din 2 subunitati: F VIIIc care este factor plasmatic al coagularii si FvW

> este cofactor al activarii F X

> deficitul = hemofilia A (gena ce codifica sinteza F VIII se gaseste pe cromozomul X, iar hemofilia se transmite prin heterozigotism X, prin urmare boala afecteaza doar sexul masculin).

o F IX = globulina antihemofilica B (factorul Christmas)

> se sintetizeaza în ficat în prezenta vitaminei K, are o GM de 55 kDa

> deficitul = hemofilia B

o F X = factorul Stuart Prower (antiprotrombina C)

> se sintetizeaza în ficat în prezenta vitaminei K

> este o GP cu GM de 55 kDa

> se activeaza prin scindare proteolitica, prin 2 cai: intrinseca si extrinseca

> factorul Xa intra în alcatuirea complexului activator al protrombinei

> deficit = hemofilia B

o F XI = globulina antihemofilica C (factorul Rosenthal)

> se sintetizeaza în ficat în prezenta vitaminei K

> este e GP cu GM de 160 kDa

> deficitul = hemofilia C

o F XII = factorul de contact (Hageman)

> se sintetizeaza în ficat

> activarea sa duce la declansarea caii intrinsece a coagularii

> F XIIa declanseaza si procesul de fibrinoliza, activeaza fractiunea C1 a complementului si sistemul kininoformator

o F XIII = factorul stabilizator al fibrinei (Laki-Lorand)

> se gaseste în plasma si în plachete

> are 2 lanturi polipeptidice a si b si o GM = 320 kDa

> este activat de trombina

> transforma fibrina solubila în fibrina insolubila

Alti factori implicati în coagulare:

o FvW

o F XV = prekalicreina (factorul Fletcher)

> sintetizat în ficat

> accelereaza activarea F XII

> în plasma este asociat cu HMWK (kininogenul cu GM mare)

> prekalicreina ? XIIa => kalicreina - - -feedback poz. - - - => activeaza fact. XII în XIIa

o F XVI (factorul Fitzgerald) sau HMWK

> accelereaza activarea F XI

> fixeaza prekalicreina

CASCADA COAGULARII

Presupune activarea în cascada a coagularii si are ca scop formarea dopului fibrinoplachetar.

> Calea intrinseca:

Presupune o leziune endoteliala cu denudarea colagenului din matricea subendoteliala. Contactul cu colagenul (încarcat negativ) activeaza factorul XII care sub actiunea kalicreinei sau plasminei va deveni factorul XIIa (acesta la rândul sau va activa prekalicreina => conexiuni între coagulare, fibrinoliza si reactia inflamatorie). Factorul XIIa activeaza prin proteoliza partiala factorul XI (cofactor: HMWKG), care la rândul sau va activa proteolitic F IX. F IX, împreuna cu F VIII, FP3 si ionii de Ca2+ vor forma complexul activator al factorului X pe cale intrinseca.

> Calea extrinseca:

În contact cu tromboplastina tisulara expusa în urma leziunii endotaliale, F VII este activat. Tromboplastina tisulara, împreuna cu F VII si ionii de Ca2+ vor forma complexul activator al factorului X pe cale extrinseca.

> Calea comuna:

Factorul Xa (activat pe una dintre cele 2 cai), împreuna cu F V, FP3 si ionii de Ca2+ formeaza complexul activator al protrombinei = protrombinaza. Deoarece F VII se poate activa si spontan, lent, în plasma exista un factor care inhiba activarea F X pe cale extrinseca numit factor EPI (extrinsec pathway inhibitor).

Protrombinaza (F Xa + F V + Ca2+ +FP3) scindeaza protrombina (69.700 Da) pâna la trombina (33.700 Da), care la rândul ei va determina transformarea fibrinogenului în fibrina. Trombina mai activeaza de asemenea si factorii V, VIII, XIII si proteina C, stimuleaza agregarea plachetara si metamorfoza vâscoasa.

Dupa despinderea fibrinopeptidelor A si B, rezulta monomerul de fibrina. Acesta trimerizeaza spontan realizând o retea tridimensionala. Initial, fibrina este instabila, solubila; F XIII (activat de trombina) intervine prin formarea de legaturi disulfidice între monomerii de fibrina, formând fibrina insolubila.

Timpul trombodinamic

Consta în scaderea volumului cheagului prin sinereza (proces de reorganizare spatiala si retractie a cheagului printr-un mecanism activ - consumator de ATP, cu ajutorul proteinelor contractile - trombostenina) si expluzarea serului.

Controlul coagularii

Se face prin substante anticoagulante (naturale sau artificiale) si prin fibrinoliza.

o Anticoagulanti naturali: sunt factori care previn coagularea spontana intravasculara în conditiile unei activari accidentale a mecanismelor coagularii.

> Anti-tromboplastina:

· extrinseca - formata din EPI + F Xa

· intrinseca - formata din proteinele C,S; Proteina C inhiba F Va , F IXa, F Xa, F VIIIa.

> Antitrombine (AT):

· AT 1

· AT 2 - cofactor al heparinei

· AT 3 - cea mai puternica AT

· AT 4 - produsii de degradare ai fibrinei: FDP ( D sau E )

· a2 - macroglobulina

> Hirudina - un anticoagulant natural produs de lipitori

> Heparina - este un MPZ produs de mastocite si bazofile perivasculare si de cele circulante

> Inhibitori patologici: în urma transfuziilor repetate pot aparea anticorpi antifactori ai coagularii

o Anticoagulantii artificiali: utilizati terapeutic sau pentru analize de laborator. În terapia anticoagulanta se folosesc agenti antivitamina K (acenocumarol) care blocheaza sinteza factorilor K dependenti, iar pentru recoltarea sângelui în vederea diverselor analize se folosesc substante care fixeaza Ca (citrati, oxalati, saruri de EDTA). Ca intervine în toate etapele coagularii cu exceptia aderarii plachetare si activarii F XII si F XI.

o Sistemul anticoagulant al proteinei C: proteina C este o proteaza de origine hepatica, dependenta de vitamina K si activata de trombina. Ea inactiveaza prin proteoliza factorii V si VIII, formând o bucla de feedback neg. în controlul coagularii.

Explorarea coagularii

· Tipul de sângerare:

o metoda Duke:

> se incizeaza lobul urechii cu o adâncime de 2-3 mm. Se cronometreaza scurgerea sângelui, tamponând din 30 în 30 de secunde cu o hârtie de filtru. Când hârtia nu se mai pateaza, se opreste cronometrul.

> valori normale: 2-4 minute.

> exploreaza hemostaza primara (se alungeste în trombocitopenii sau trombocitopatii).

· Testul fragilitatii capilare (Rumpell-Leed):

> se comprima cu manseta tesiometrului artera brahiala si se realizeaza o staza venoasa timp de 10 minute mentinând presiunea din manson la valori între TA max si TA min. Normal, în teritoriul cutanat situat sub manson nu trebuie sa apara petesii (hemoragii mici, punctiforme, subcutanate). Testul este pozitiv daca apar mai mult de 5 petesii.

> exploreaza hemostaza primara (este pozitiv în trombocitopenii si vasculopatii).

· Numarul de trombocite:

o se numara trombocitele într-o camera de numarat elementele figurate.

o scaderea numarului de trombocite (trombocitopenie) duce la deficite ale hemostazei primare si sindroame hemoragice.

· Timpul de coagulare (metoda Lee-White):

o prin punctie venoasa se recolteaza 1-2 ml sânge si se pune în eprubeta; se masoara timpul necesar pâna când se formeaza cheagul

o valori normale: 8-10 minute.

o exploreaza global coagularea.

· Timpul de recalcifiere (Howell):

o se recolteaza sânge venos pe citrat de Na si se separa plasma prin centrifugare. Plasma pacientului se trateaza cu clorura de Ca si se cronometreaza timpul necesar formarii cheagului de fibrina.

o valori normale: 1min 10 sec - 2 min 10 sec.

o exploreaza global coagularea.

· Timpul de protrombina (Quick):

o se pune tromboplastina tisulara în contact cu plasma si clorura de Ca. Plasma normala, în contact cu tromboplastina tisulara si în prezenta Ca coaguleaza rapid.

o valori normale: 12-14 sec

o exploreaza calea comuna si extrinseca a coagularii (TQ este prelungit în deficitul de F VII, X, V, II, I)

· Dozarea fibrinogenului:

o se poate face prin metoda ponderala (transformare în fibrina în prezenta trombinei, uscare si cântarire) sau dupa separarea prin electroforeza.

o valori normale: 200-400 mg/dl în plasma.

· INR (International Normalized Ratio) = raport între valoarea standard a timpului de protrombina si valoarea timpului de protrombina la pacient; se dozeaza pentru evaluarea tratamentului anticoagulant.

FIBRINOLIZA

Reprezinta ansamblul proceselor care duc la liza enzimatica a cheagului de fibrina, repermeabilizarea vasului lezat si restabilirea circulatiei. Împreuna cu hemostaza asigura echilibrul fluidocoagulant. Efectorul principal este o proteaza - plasmina - care este activata prin proteoliza partiala din plasminogen.

> Plasminogenul este o proteina cu GM 92 kDa care este sintetizata în ficat, se gaseste în plasma într-o concentratie de 15 mg/dl si are un timp de semiviata de 2-3 zile.

>Plasmina rezulta din plasminogen prin proteoliza partiala, sub actiunea unor activatori. Are GM 83 kDa si o specificitate de substrat destul de larga. Plasmina poate liza nu numai fibrina (pentru care are afinitate maxima) ci si alte proteine plasmatice ca de exemplu FV, FVIII si fibrinogenul.

Procesul de fibrinoliza începe din interiorul cheagului fibrinoplachetar, deoarece aici se gasesc factori profibrinolitici.

Activarea plasminogenului

Se poate face pe 2 cai - intrinseca si extrinseca:

a. Activatorul tisular al plasminogenului (tPA) - prezent în aparatul lizozomal al majoritatii celulelor (în cantitati mari în uter, plamân, prostata, suprarenale)

b. Activatorul endotelial al plasminogenului (ePA) - sintetizat la nivelul celulelor endoteliale vasculare ca urmare a stimularii ß adrenergice sau ischemiei locale.

c. Urokinaza - este o enzima produsa de epiteliul cailor urinare care se elimina în cantitati mici în urina, dar care trece si în plasma.

d. F XIIa - activeaza sistemul prekalicreina-kalicreina; kalicreina la rândul ei stimuleaza activarea plasminogenului în plasmina.

*** tPA si ePA sunt puternic stimulati chiar de prezenta fibrinei.

Alti activatori: streptokinaza, stafilokinaza, eterul, cloroformul, catecolaminele, ADH, trombina.

Mecanismul fibrinolizei:

Reteaua de fibrina absoarbe plasminogenul, care este activat la plasmina. Plasmina începe sa scindeze fibrina prin proteoliza, rezultând produsi de degradare ai fibrinei (FDPs):

> X , Y - se opun polimerizarii monomerilor de fibrina

> D, E - numiti si antitrombina VI (produsul E este si blocant al receptorilor plachetari pentru fibrinogen, având si efect antiagregant)

Reglarea fibrinolizei

Exista o serie de inhibitori ai fibrinolizei care nu permit activarea accidentala a plasminogenului si declansarea activitatii fibrinolitice. Inhibitorii fribrinolizei sunt antiproteaze cu structura glicoproteica fara o specificitate stricta de substrat (inhiba sistemul fibrinolitic dar si proteaze ale sistemului coagulant, ale sistemului kininoformator sau ale sistemului complementului).

Inhibitorii fiziologici sunt:

o ai activatorilor plasminogenului - inhiba kinazele care activeaza plasminogenul; cel mai important este IAI 1, secretat de endotelii si de granulele clare plachetare.

o ai plasminei :

- a2 - antiplasmina: secretata de ficat

- a2 - macroglobulina

- a1 antritripsina

- FP8

- AT III

o F XIII este antifibrinolitic.

Inhibitorii utilizati în terapie: acidul e aminocapronic.